6.20.2005

Interaccion antigeno anticuerpo

Interacción antígeno-anticuerpo.

Afinidad y avidez
La interacción entre antígeno y anticuerpo se estabiliza mediante enlaces débiles, como puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Wals e interacciones electrostáticas e hidrofóbicas. La suma de todos estos enlaces genera una interacción estable entre el lugar de unión del anticuerpo (paratope) y el lugar de unión del antígeno (epítope). Estas fuerzas son inversamente proporcionales a una potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo que implica que epítope y paratope deben presentar estructuras complementarias para obtener una energía de unión suficiente como para resistir la disrupción termodinámica. La suma de estas fuerzas de atracción y de repulsión se conoce como afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos son moléculas multivalentes en su interacción con el antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina presentan un máximo de 10 (IgM) y un mínimo de 2 brazos de unión con el antígeno. En el caso de que este último también sea multivalente, presentará un mínimo de dos puntos de anclaje para el anticuerpo correspondiente. Esta interacción multivalente entre antígeno y anticuerpo permite introducir el concepto de avidez o afinidad funcional.
Especificidad y reacción cruzada
La complementariedad existente entre epítope y paratope condiciona la relación específica entre antígeno y anticuerpo. Dicha complementariedad afecta tanto a una relación espacial entre los grupos químicos reaccionante, a la relación complementaria de cargas netas como a la relación estérica entre las estructuras reaccionantes.
En general los anticuerpos son altamente específicos, siendo capaces de discernir entre pequeñas variaciones del antígeno, tanto a nivel de estructura primaria como de conformación estérica o configuración óptica del mismo.
La relación entre un antisuero o anticuerpo determinado y el antígeno que ha dado lugar a su producción se conoce como interacción específica. Cuando el antisuero da reacción positiva con otros antígenos, relacionados o no con el utilizado en la inmunización, se habla de reacción cruzada.
Pueden establecerse interacciones de baja afinidad entre un anticuerpo y antígenos que presenten epítopos no relacionados. Así mismo determinados grupos químicos pueden generar interacciones no específicas entre éstos y el anticuerpo (determinados fijadores utilizados en inmunohistoquímica como el paraformaldehído y el glutaraldehído generan grupos amino libres altamente reactivos). Dichas interacciones se definen como inespecíficas (señal de fondo) y pueden soslayarse modificando las condiciones del ensayo. Así, un incremento en la fuerza iónica o la presencia de detergentes a bajas concentraciones sólo permiten el establecimiento de interacciones de alta afinidad. La utilización de agentes saturantes, por ej. soluciones de proteínas o aminoácidos pueden actuar como bloqueantes de grupos reactivos presentes en la preparación.
En un sentido amplio la especificidad de un anticuerpo debe ser entendida como de "lugar específico" más que como de "antígeno específico", así la existencia de estructuras ("lugares") relacionadas en antígenos distintos pueden dar reacción positiva con anticuerpos no relacionados.
Caracterización de la especificidad
En todo planteamiento experimental en el que se utilicen anticuerpos como marcadores es necesario establecer unos estrictos controles de "autenticidad" de los resultados obtenidos. De entre las distintas técnicas inmunoquímicas, quizá sea en la inmunocitoquímica donde esta consideración adquiere un carácter de estricta necesidad.
Los aspectos que de manera distinta afectan la especificidad de la interacción antígeno-anticuerpo son diversos. Uno de ellos es el grado de pureza del antígeno utilizado en la inmunización. Salvo en el caso de los anticuerpos monoclonales un anticuero obtenido contra un antígeno no purificado presentará un porcentaje variable de anticuerpos no específicos que pueden enmascarar el resultado esperado. Además la naturaleza del antígeno juega un papel importante en las reacciones no específicas. Así, cuando se trabaja con anticuerpos anti-péptidos con actividad biológica (hormonas, factores de crecimiento, etc...) de carácter ubícuo y de gran similitud estructural dan lugar a reacciones cruzadas. En ciertos casos esta reacción cruzada puede ser aprovechada para inmunodetectar péptidos relacionados de especies distintas, utilizando anticuerpos específicos contra una determinada especie. En estos casos es donde más exigentes deben ser las condiciones del ensayo y los controles utilizados.
Cada uno de los pasos de un determinado protocolo debe incorporar un control tanto positivo como negativo. En las figuras siguientes se esquematizan distintos tipos de control de un ensayo de inmunodetección indirecto.


Como control negativo se puede emplear

. un anticuerpo no reactivo (suero preinmune, sobrenadante de la línea mielomatosa, etc...)

. una muestra en la que se haya demostrado la no presencia del antígeno de interés

. o desarrollar el ensayo en ausencia del primer anticuerpo. A este control se le denomina también control de secundario y sirve para estimar la especificidad del segundo anticuerpo.

Como control positivo puede utilizarse una muestra que contenga el antígeno puro o que haya sido caracterizada su presencia por métodos alternativos.

La especificidad puede ser determinada de manera indirecta incorporando en la incubación con el primer anticuerpo antígeno en solucion, o bien antígenos que puedan tener reacción cruzada con el de interés. Este tipo de ensayo se denomina de competición.
Una forma de asegurar la especificidad de un antisuero es purificar aquellos anticuerpos que tengan una mayor especificidad. Esto es posible mediante cromatografía de afinidad, técnica basada en una cromatografía del antisuero a través de una columna cuya matriz es sefarosa (Pharmacia) a la que se ha unido covalentemente el antígeno. La elución de los anticuerpos unidos se realiza aumentando la fuerza iónica.


Es importante emplear técnicas alternativas que permitan determinar la especificidad del anticuerpo. Las más utilizadas en la actualidad son : inmunoprecipitación, inmunodifusión o inmunoelectroforesis, radioinmunoensayo (RIA), ELISA ('Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay'), inmunoblot, etc.

Es de gran importancia considerar al determinar la especificidad del anticuerpo que será usado en un ensayo inmunocitoquímico que los fijadores pueden tener una gran influencia sobre la antigenicidad, y es por ello recomendable emplear aquella metodología que mantenga el antígeno en la forma más similar posible a la que se presentará en el tejido.