6.20.2005


Cataratas Iguazu
HGR

Tecnica basica de inmunohistoquimica

Procesamiento inmunohistoquímico

Dependiendo del tipo de muestra sobre la que se desea aplicar el procedimiento inmunohistoquímico es necesario tratarla para conseguir por ejemplo una superficie hidrofóbica que permita la entrada de las soluciones acuosas, desenmascarar los epítopes que bloqueados por efecto del fijador, bloquear todas las uniones inespecíficas, grupos reactivos, etc...

Los métodos que lo permiten se describen a continuación.

Procesamiento en portaobjetos y por flotación 'free floating'
La detección inmunohistoquímica de un antígeno se puede se realizar bien sobre secciones o muestras unidas a un portaobjetos o sobre cortes en flotación ('free floating').
El primer método se emplea para los tejidos incluidos en plástico o en parafina. Los cortes obtenidos mediante vibratomo, micrótomo de congelación y criostato se pueden procesar tanto sobre portaobjetos como por flotación.

En el procesamiento sobre portaobjetos es necesario unir los cortes a la superficie del portaobjetos. Esto se consigue empleando bien portas previamente gelatinados (gelatina 0.5% alúmina de cromo 0.01%), con poli-l-lisina de 350000 Da (0.05 al 0.1%) o empleando portaobjetos con carga positiva.
En el caso de los cortes adheridos al portaobjetos es importante tener cuidado con los tratamientos proteolíticos pues pueden facilitar el despegamiento de los cortes.
Las incubaciones se realizan mediante una gota (5 a 50 microL) que se deposita sobre la sección histologica. Para evitar la extensión de la gota se puede delimitar un area circular con lapiz hidrofobo.

En el proceso de flotación los cortes se recogen y procesan en recipientes especialmente diseñados: cilindros abiertos por la base que se ha cubierto con una fina malla (media). El protocolo inmunocitoquímico es rápido y sencillo. En cada recipiente se pueden procesar de 50 a 100 secciones. Todas las incubaciones y lavados se hacen con agitación constante, en un agitador rotatorio u orbital. Este procedimiento asegura la máxima penetración y homogeneidad de tinción.

Las preparaciones completas o 'whole mount' también se procesan por el procedimiento de flotación. En este caso, según el tipo de muestras de que se trate se usan tubos eppendorf.

Las principales ventajas e inconvenientes de uno y otro método son las siguientes :
Ventajas

Procesado sobre portaobjetos
  1. los cortes pueden ser finos (<4 micrones) y seriados
  2. apropiado para tejidos poco homogéneos
  3. una vez finalizado el proceso inmunohistoquímico el montaje es inmedia
  4. se precisa poca cantidad de anticuerpo

Desventajas

  1. proceso más lento y laborioso
  2. se procesan pocos cortes pos experimento
  3. la reacción puede no ser homogéneo

Procesado por flotación

  1. proceso de elevado rendimiento (se procesan de 5 a 100 cortes)
  2. máxima penetración de los anticuerpos
  3. reacción homogénea en todo el corte
  4. adecuado para cortes gruesos (> 20 microm)
  5. permite recuperar las soluciones de anticuerpos para su reutilización
  6. no es adecuado para cortes finos (< 10 microm) en tejidos poco cohesionados
  7. una vez terminado el protocolo inmunohistoquímico los cortes se han de montar

no permite emplear cortes seriados


Preincubaciones
Una vez obtenidos los cortes y antes de iniciar las incubaciones con los anticuerpos se han de hacer diversas preincubaciones y lavados a fin de facilitar la penetración de los anticuerpos y disminuir el marcaje inespecífico. Generalmente todas las preincubaciones se realizan en tampón (fosfato o tris-HCl) o en solución salina tamponada. En el caso de que el proceso se realice sobre portaobjetos gelatinizados hay que calentarlos previamente entre 37 y 50ºC (dependiendo de la sensibilidad de los antígenos a la temperatura) durante 10 min.


Permeabilización del tejido


Este paso se realiza para facilitar el acceso de los anticuerpos al interior del tejido. El método más común es el tratamiento con una solución de detergente (Tritón X-100, saponina o Tween 20) al 0.1 -1%. En ocasiones este tratamiento es suficiente para asegurar una fácil penetración de los anticuerpos. Sin embargo es conveniente hacer el resto de incubaciones y lavados con soluciones que contengan una concentración más baja de detegente (por ej. Tritón X-100 al 0.05-0.2%). La concentración de detergente se determina en cada caso y está muy relacionada con el tipo de fijación empleada. Si los cortes se han obtenido por congelación el pretratamiento con detergentes no es estrictamente necesario, especialmente si el grosor del corte no supera las 6-8 microm. La utilización de detergentes en los procesos de inmunodetección de antígenos de membrana está contraindicada.


Un método alternativo de permeabilización consiste en congelar y descongelar el tejido repetidamente. Es un método sencillo pero que destruye la estructura y es poco repetible.


Un tercer método consiste en el tratamiento con proteasas. Normalmente los cortes se someten a la acción de la pepsina, tripsina o pronasa durante 15 a 30 min a 37ºC. La concentración del enzima varia según el proceso histológico utilizado (fijación, grosor de los cortes, etc...), del antígeno a detectar y del tipo de tejido. Normalmente se emplean en el rango 0.1 a 1 mg/mL. Es obvio que un tratamiento fuerte con proteasas puede afectar gravemente la conservación estructural del tejido. Frecuentemente también provoca que el corte se desenganche fácilmente del protaobjetos, ya que las proteasas también digieren la gelatina. La digestión con proteasas es muy recomendable en el caso de tejidos fijados con altas concentraciones de glutaraldehido.


Un cuarto método consiste en tratar los tejidos con una escala creciente de etanol (5 a 10 min en cada etanol) y finalmente sumergirlos en xilol. Este proceso permeabiliza extrayendo parte de los lípidos presentes en el tejido. Es muy eficaz y permite una conservación estructural óptima. No obstante no se puede emplear siempre ya que puede disminuir o eliminar la antigenicidad de algunos epítopos. Se emplea para incrementar la permeabilidad de cortes gruesos (>100 microm) y preparaciones enteras ('whole mount').
Por último la fijación también puede facilitar la permeabilización, mediante el uso de tampones hipoosmóticos (0.04 M) o de soluciones de pH variados (métododel doble pH).
Los diferentes métodos de permeabilización no son excluyentes y existen protocolos en los que se emplean dos secuencialmente.


Bloqueo de uniones inespecíficas
Este paso tiene la doble función de bloquear los radicales libres reactivos presentes en el tejido de manera natural o introducidos como consecuencia de la fijación (generalmente de tipo aldehido) y saturar las uniones de los anticuerpos con proteínas.
El primer objetivo se consigue saturando el tejido de moléculas de bajo peso molecular que reaccionan con radicales aldehido. Generalmente se emplea el borohidruro de sodio o el cloruro amónico (0.5 M).
Para el segundo objetivo se han probado diferentes estrategias : saturación de los cortes con una concentración elevada (1-10%) de albúmina sérica bovina (BSA), de suero preinmune de la especie donadora del segundo anticuerpo o de otra especie diferente a la donadora del primario (5-10%), de suero bovino fetal (FCS) (5-10%) y con leche en povo desnatada (Molico, Nestlé) (5 %). En los métodos de inmunomarcaje indirecto o de puente es conveniente que el suero normal sea de la misma especie que la del anticuerpo secundario o alternativamente de especies filogenéticamente próximas.
Saturación de peroxidasas endógenas
La eliminación de la actividad peroxidasa endógena sólo es necesario cuando se emplea peroxidasa (HRP) como marcador. Se consigue incubando los cortes con una solución de peróxido de hidrógeno (0.3-3%) y metanol (1-10%) de 2 a 10 min. De este modo se bloquea la actividad peroxidasa de las células, salvo de las sanguineas. Es por ello recomendable que en los procedimientos que empleen HRP como marcador los tejidos se obtengan mediante perfusión.
Desenmascaramiento de epítopos
Durante la fijación y en los métodos post-inclusión muchos epítopos antigénicos pueden ser destruidos o enmascarados. Los procedimientos que provocan destrucción de epítopos son las condiciones hidrofóbicas y de alta temperatura que sufren las muestras al incluirlas en parafina por ej., o en la inclusión en resinas tipo Epon, Araldita, Lowycril 4Km y LR-White.
Se ha descrito que el tratamiento de secciones desparafinadas con urea 3 M (5 min a temperatura. ambiente) desenmascara epítopos. Otra estrategia que funciona en ocasiones es el tratamiento del corte con enzimas proteolíticos : tripsina, pepsina, quimotripsina y pronasa.


Incubaciones con el anticuerpo primario


Guia de uso de los anticuerpos primarios

Los anticuerpos primarios puede ser :

  1. monoclonales en cultivo o líquido ascítico
  2. anticuerpos monoclonales o policlonales purificados
  3. antisueros policlonales


Es aconsejable la purificación de las IgG (con proteína A-Sepharosa, o por afinidad con el antígeno) ya que elimina enzimas séricos y proteínas que pueden producir inespecificidad (por ej. alfa2-macroglobulina). Sin embargo esto no siempre es posible debido a las pequeñas cantidades de anticuerpo disponibles.


El antisuero policlonal es frecuentemente una fuente importante de contaminantes, bien debido a las fuentes del antígeno o a las condiciones del animal inmunizado. Una estrategia que permite la eliminación de estos contaminantes es la absorción del antisuero con polvo acetónico de tejidos que no presenten el antígeno.


Una guia para el uso de anticuerpos policlonales podría ser :
. la producción de anticuerpos se ha de realizar a partir de antígenos puros.
. los animales inmunizados se han de mantener en las condiciones de máxima higiene posibles
. cuando sea posible purificar los anticuerpos mediante cromatografía de afinidad con el antígeno unido a sepharosa.
. determinar las diluciones óptimas de trabajo con el anticuerpo primario
. inmunoteñir a la concentración óptima más elevada
. incubar las secciones en presencia de anticuerpos diluidos en soluciones que contengan proteínas inertes (por ej. albúmina, gelatina, FCS, etc...)
. hacer controles de absorción y tinción desde el principio


Composición del medio de incubación
El medio de incubación del anticuerpo primario puede ser tampón fosfato o tris-HCl (0.1-0.15 M, pH 7.0-7.6).

Sin embargo conviene añadir una concentración 0.154 M (0.9%) de NaCl que reduce los enlaces inespecíficos producidos por fuerzas iónicas y hidrofílicas presentes en el tejido.

Se puede emplear BSA (0.1-3%), FCS (5-10%), gelatina (0.1-0.2%) o suero preinmune (1-10%) que además de competir con el anticuerpo primario por los lugares inespecíficos de unión del tejido disminuye la adherencia del anticuerpo al vidrio o plástico empleado en las incubaciones sobre porta o en flotación.
Además hay que añadir, salvo contraindicación expresa, cantidades moderadas de Tritón X-100 (0.1-0.3%) y de azida sódica (0.05-0.1%). El detergente reduce las uniones inespecíficas además de permeabilizar el tejido. La acida sódica retarda el crecimiento bacteriano y es necesaria en las incubaciones largas (> 6 h).


Diluciones, tiempo de incubación y eficiencia de detección
La dilución de anticuerpo a emplear es un aspecto fundamental en la secuencia inmunohistoquímica. Las diluciones han de ser lo más elevadas sin incrementar el marcaje inespecífico. Cuando la concentración es muy elevada se une demasiado anticuerpo inespecíficamente aumentando el ruido de fondo ('background'). Cuando la concentración es muy baja la señal es demasiado débil.


Con anticuerpos puros como los monoclonales el margen de uso oscila entre 1 y 25 microg/ml. En el caso de antisueros, líquido ascítico y preparaciones de IgG completas la dilución es necesario establecerla experimentalmente y es una característica que depende tanto de la concentración del anticuerpo (título) como del antígeno en la muestra.
Hay una fuerte correlación entre la concentración del anticuerpo, su afinidad y la concentración de antígeno. Con un antígeno abundante y en áreas localizadas, el anticuerpo ha de estar muy diluido, y siempre un anticuerpo de baja a media afinidad puede provocar una reacción intensa. Sin embargo, cuando el antígeno se encuentra en concentraciones bajas el anticuerpo ha de estar más concentrado y un anticuerpo con una avidez media a baja (como los purificados por afinidad) puede no detectarlo claramente.


Otro factor de gran importancia, con implicaciones sobre la dilución, la eficiencia en la detección y la sensibilidad de los protocolos inmunochistoquímicos es el tiempo de incubación con el anticuerpo y la temperatura. El anticuerpo primario puede estar en contacto con la muestra entre 1 y 72 h, dependiendo del grosor de los cortes, el grado de permeabilización, el título del anticuerpo y la afinidad.

Los efectos beneficiosos del incremento del tiempo en la incubación varian entre los diferentes anticuerpos, pero en algunos casos producen un incremento en el marcaje de 100 veces respecto a las incubaciones de tiempo corto. Sin embargo es necesario tener presente que con anticuerpos de baja afinidad los tiempos largos de incubación pueden incrementar el ruido de fondo. Respecto a la temperatura : se recomienda trabajar a temperaturas bajas (4ºC) para incubaciones largas (>12 h) y a temperatura ambiente o 37ºC para incubaciones cortas.


Fenómeno de 'prozone'. Implicaciones en la cuantificación
Si los anticuerpos no están suficientemente diluidos se observa un fenómeno particular denominado 'prozone'. Este se observó por vez primera en 1974 por Bellon y Druet : con altas concentraciones de anticuerpo, empleando tanto marcaje fluorescente como peroxidasa, no presentaban nada de señal. Si se diluían los anticuerpos aparecía la señal. Si las secciones tratadas con altas concentraciones de anticuerpos se trataban con papaína (rompe los fragmentos Fc) antes de la aplicación del anticuerpo secundario, también se detectaba marcaje. El fenómeno no se produce si se emplean Fb. Concluyeron que la inhibición del marcaje era debida a impedimentos estéricos. Así, si se emplean altas concentraciones de anticuerpos primarios para marcar lugares ricos en epítopos, el acúmulo de anticuerpos puede impedir el reconocimiento de los secundarios. Es evidente que este fenómeno no aparece con los métodos indirectos de inmunotinción.
Este fenómeno tiene dos implicaciones importantes : ilustra la necesidad de determinar experimentalmente la dilución óptima de trabajo y demuestra que la eificiencia de detección en áreas con antígenos densamente empaquetados es siempre inferior al 100%.


Almacenamiento de anticuerpos y de diluciones
Los anticuerpos no conjugados y los acomplejados pueden mantenerse a 4ºC durante algunos meses (de 2 a 4) si se añade a la solución algún antibacteriano. Para almacenar estos anticuerpos durante tiempos más prolongados hay que alicuotarlos en cantidades pequeñas y mantenerlos congelados a una temperatura inferior a -20 ºC (idealmente a -80ºC). De esta forma la actividad se mantiene durante años. Se recomienda en general un almacenamiento a 4ºC de los anticuerpos conjugados (FITC, DRP, TRITC, ...) ya que la congelación puede romper el enlace entre el anticuerpo y el marcador.

Es importante tener presente que los recipientes empleados para el almacenamiento de los anticuerpos puede unir anticuerpos. Este efecto se reduce si se almacenan en presencia de una proteína inerte (BSA; HSA al 0.25-1%).
Las diluciones de anticuerpo primario y secundario se pueden reutilizar en diversas incubaciones. El número de veces que puede reutilizarse depende del sistema de almacenamiento y de la concentración del antígeno en el tejido. Entre una incubación y otra las soluciones se pueden mantener a 4ºC si contienen acida sódica. Sin embargo, dado que la concentración de antígeno es dificil de estimar hay que evitar siempre que sea posible la reutilización de las soluciones.

Interaccion antigeno anticuerpo

Interacción antígeno-anticuerpo.

Afinidad y avidez
La interacción entre antígeno y anticuerpo se estabiliza mediante enlaces débiles, como puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Wals e interacciones electrostáticas e hidrofóbicas. La suma de todos estos enlaces genera una interacción estable entre el lugar de unión del anticuerpo (paratope) y el lugar de unión del antígeno (epítope). Estas fuerzas son inversamente proporcionales a una potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo que implica que epítope y paratope deben presentar estructuras complementarias para obtener una energía de unión suficiente como para resistir la disrupción termodinámica. La suma de estas fuerzas de atracción y de repulsión se conoce como afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos son moléculas multivalentes en su interacción con el antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina presentan un máximo de 10 (IgM) y un mínimo de 2 brazos de unión con el antígeno. En el caso de que este último también sea multivalente, presentará un mínimo de dos puntos de anclaje para el anticuerpo correspondiente. Esta interacción multivalente entre antígeno y anticuerpo permite introducir el concepto de avidez o afinidad funcional.
Especificidad y reacción cruzada
La complementariedad existente entre epítope y paratope condiciona la relación específica entre antígeno y anticuerpo. Dicha complementariedad afecta tanto a una relación espacial entre los grupos químicos reaccionante, a la relación complementaria de cargas netas como a la relación estérica entre las estructuras reaccionantes.
En general los anticuerpos son altamente específicos, siendo capaces de discernir entre pequeñas variaciones del antígeno, tanto a nivel de estructura primaria como de conformación estérica o configuración óptica del mismo.
La relación entre un antisuero o anticuerpo determinado y el antígeno que ha dado lugar a su producción se conoce como interacción específica. Cuando el antisuero da reacción positiva con otros antígenos, relacionados o no con el utilizado en la inmunización, se habla de reacción cruzada.
Pueden establecerse interacciones de baja afinidad entre un anticuerpo y antígenos que presenten epítopos no relacionados. Así mismo determinados grupos químicos pueden generar interacciones no específicas entre éstos y el anticuerpo (determinados fijadores utilizados en inmunohistoquímica como el paraformaldehído y el glutaraldehído generan grupos amino libres altamente reactivos). Dichas interacciones se definen como inespecíficas (señal de fondo) y pueden soslayarse modificando las condiciones del ensayo. Así, un incremento en la fuerza iónica o la presencia de detergentes a bajas concentraciones sólo permiten el establecimiento de interacciones de alta afinidad. La utilización de agentes saturantes, por ej. soluciones de proteínas o aminoácidos pueden actuar como bloqueantes de grupos reactivos presentes en la preparación.
En un sentido amplio la especificidad de un anticuerpo debe ser entendida como de "lugar específico" más que como de "antígeno específico", así la existencia de estructuras ("lugares") relacionadas en antígenos distintos pueden dar reacción positiva con anticuerpos no relacionados.
Caracterización de la especificidad
En todo planteamiento experimental en el que se utilicen anticuerpos como marcadores es necesario establecer unos estrictos controles de "autenticidad" de los resultados obtenidos. De entre las distintas técnicas inmunoquímicas, quizá sea en la inmunocitoquímica donde esta consideración adquiere un carácter de estricta necesidad.
Los aspectos que de manera distinta afectan la especificidad de la interacción antígeno-anticuerpo son diversos. Uno de ellos es el grado de pureza del antígeno utilizado en la inmunización. Salvo en el caso de los anticuerpos monoclonales un anticuero obtenido contra un antígeno no purificado presentará un porcentaje variable de anticuerpos no específicos que pueden enmascarar el resultado esperado. Además la naturaleza del antígeno juega un papel importante en las reacciones no específicas. Así, cuando se trabaja con anticuerpos anti-péptidos con actividad biológica (hormonas, factores de crecimiento, etc...) de carácter ubícuo y de gran similitud estructural dan lugar a reacciones cruzadas. En ciertos casos esta reacción cruzada puede ser aprovechada para inmunodetectar péptidos relacionados de especies distintas, utilizando anticuerpos específicos contra una determinada especie. En estos casos es donde más exigentes deben ser las condiciones del ensayo y los controles utilizados.
Cada uno de los pasos de un determinado protocolo debe incorporar un control tanto positivo como negativo. En las figuras siguientes se esquematizan distintos tipos de control de un ensayo de inmunodetección indirecto.


Como control negativo se puede emplear

. un anticuerpo no reactivo (suero preinmune, sobrenadante de la línea mielomatosa, etc...)

. una muestra en la que se haya demostrado la no presencia del antígeno de interés

. o desarrollar el ensayo en ausencia del primer anticuerpo. A este control se le denomina también control de secundario y sirve para estimar la especificidad del segundo anticuerpo.

Como control positivo puede utilizarse una muestra que contenga el antígeno puro o que haya sido caracterizada su presencia por métodos alternativos.

La especificidad puede ser determinada de manera indirecta incorporando en la incubación con el primer anticuerpo antígeno en solucion, o bien antígenos que puedan tener reacción cruzada con el de interés. Este tipo de ensayo se denomina de competición.
Una forma de asegurar la especificidad de un antisuero es purificar aquellos anticuerpos que tengan una mayor especificidad. Esto es posible mediante cromatografía de afinidad, técnica basada en una cromatografía del antisuero a través de una columna cuya matriz es sefarosa (Pharmacia) a la que se ha unido covalentemente el antígeno. La elución de los anticuerpos unidos se realiza aumentando la fuerza iónica.


Es importante emplear técnicas alternativas que permitan determinar la especificidad del anticuerpo. Las más utilizadas en la actualidad son : inmunoprecipitación, inmunodifusión o inmunoelectroforesis, radioinmunoensayo (RIA), ELISA ('Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay'), inmunoblot, etc.

Es de gran importancia considerar al determinar la especificidad del anticuerpo que será usado en un ensayo inmunocitoquímico que los fijadores pueden tener una gran influencia sobre la antigenicidad, y es por ello recomendable emplear aquella metodología que mantenga el antígeno en la forma más similar posible a la que se presentará en el tejido.

Generalidades sobre anticuerpos

Anticuerpos
Los anticuerpos son moléculas de peso molecular aproximado de 150 kDa, pertenecientes al grupo de las inmunoglobulinas (Ig). Son moléculas capaces de reconocer otras moléculas, los antígenos. La capacidad de reconocimiento de un anticuerpo radica en las secuencias variables de sus cadenas proteicas, generadas por recombinación de una serie de 'gene cassettes" en el proceso de producción de los linfocitos B durante el desarrollo embrionario. La combinatoria de estas secuencias puede producir más de un billón de secuencias diferentes. Esta información es almacenada en el 'pool' de linfocitos B presentes en nuestro tejido limfático.

La estructura básica de un anticuerpo se esquematiza en la figura : formado por dos cadenas proteicas pesadas y dos livianas, unidas por puentes disulfuro. Se dividen en varias clases que se identifican según el tipo de cadena pesada en : IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
La acción de enzimas proteolíticas sobre los anticuerpos permite obtener fragmentos que presentan actividades biológicas diferenciales. Los fragmentos obtenidos son :
Fc. Corresponde al extremo C-terminal de las dos cadenas pesadas. Este fragmento está constituido por la región constante de la cadena pesada y es característica de cada clase de inmunoglobulinas. Es en esta región donde radican las funciones efectoras de la molécula como son la fijación del complemento, la interacción con los receptores celulares de monocitos y macrófagos, la interacción con la proteína A de S. aureus y G de Streptococcus sp. etc... La región Fc es característica de especie.
F(ab)2. Corresponde al extremo N-terminal de las dos cadenas pesadas y a las dos cadenas ligeras. Se obtiene por digestión con pepsina. Tiene reconocimiento divalente del epítopo.
F(ab). Corresponde al extremo N-terminal de una cadena pesada y a una cadena ligera, unidas por puentes disulfuro. Se obtiene por digestión con papaina. Tiene reconocimiento monovalente del epítopo.
De las distintas clases de inmunoglobulinas las que se encuentran predominantemente en el suero de animales inmunizados son las IgM y las _IgG. Las IgM se sintetizan durante la respuesta primaria y se asocian en una estructura pentamérica. Su capacidad de reconocimiento de epítopos es por ello de 10. Las IgG se sintetizan tanto durante la respuesta primaria como secundaria, siendo en esta última donde se consiguen los mayores niveles de producción. Su acción bivalente les permite interactuar con más de una molécula de antígeno.
El uso de una u otra Ig en un procedimiento inmunocitoquímico está limitado por su poder de penetración en la muestra. Por ello las IgM son poco utilizadas, y el estándar es la IgG. Cuando se requieren anticuerpos de un menor tamaño se utilizan enzimas proteolíticos para aislar los fragmentos correspondientes que pueden conservar (F(ab)2) o no la capacidad divalente.
Antígenos, Antigenicidad e inmunogenicidad.
Virtualmente toda molécula ajena a un determinado organismo se comporta frente a éste como un antígeno, Se pueden diferenciar dos características primordiales en un antígeno. Por una parte la inmunogenicidad o capacidad que presenta una molécula para generar una respuesta inmune en un organismo dado y la antigenicidad o particularidad del antígeno que hace que éste sea reconocido por un determinado anticuerpo. Ambas propiedades pueden o no estar presentes en un determinado antígeno. Moléculas de pequeño tamaño (haptenos o péptidos) son poco inmunogénicas y por ello se asocian a proteínas transportadoras de alto peso molecular o 'carriers' para inducir una respuesta inmune adecuada (en "Antibodies : from design to assay : a practical guide" encontrará una descripción muy detallada de la producción de anticuerpos anti-péptido). Macromoléculas ubícuas (albúminas, citocromos, etc...) o de especies filogenéticamente relacionadas, son poco inmunogénicas. En estos casos, para obtener una respuesta adecuada es aconsejable utilizar como animal huésped una especie filogenéticamente alejada a la del antígeno a inocular.
Habitualmente se emplean como antígenos puros o previamente enriquecidos mediante técnicas de concentración o de separación electroforética. Uno de los criterios de mayor importancia en la obtención de un suero monoespecífico es la inmunización con antígenos puros.
A la región del antígeno reconocida por un anticuerpo se le denomina epítope o determinante antigénico. Un antígeno puede presentar un número variable de epítopes de estructura única o repetitiva.
La complejidad estructural de las proteínas favorece que éstas presenten por lo general un número elevado de epítopes distintos, mientras que los ácidos nucleicos y los polisacáridos, dada su repetitividad estructural, poseen un número escaso de epítopes diferentes.

Inmunización y preparación del antígeno
El proceso de inmunización es aquel en el que se inyecta al animal el antígeno en condiciones adecuadas de cantidad, sustancias acompañantes, y número de veces, que sean necesarias para conseguir una buena respuesta inmune. En general se divide en dos fases : inmunización primaria, en la cual se administra una determinada cantidad de antígeno en presencia de adyuvante, y inmunización de recuerdo ('booster'), en la que el antígeno es administrado en forma soluble o bien con adyuvante. Existen numerosos protocolos de inmunización, con una duración variable, aunque un a fase de inmunización primaria suele durar de 1 a 3 meses con inyecciones cada 15 dias, y el proceso puede durar de 3 a 6 meses.
La cantidad de antígeno dependerá del animal empleado. Los más comúnmente empleados son ratón, rata, conejo, cabra y gallina. Las cantidades oscilan entre los 50 a 1000 microg de antígeno para una dosis en ratón a los 0,25 a 5 mg por dosis en el caso de la cabra o los 15 mg en el caso de caballo. Como se ha comentado, la distancia filogenética entre especies es otro factor a tener en cuenta en la elección de la especie. La utilización de la gallina como especie para obtención de anticuerpos tiene dos ventajas : la distancia filogenética existente con los mamíferos, y el hecho de que los anticuerpos pueden purificarse de la clara del huevo, facilitando en gran manera su obtención.

Anticuerpos policlonales, monoclonales, recombinantes,...
Cuando se inmuniza un animal con un antígeno y se provoca una respuesta inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Ig específicas del antígeno empleado. Esto es la consecuencia de la selección clonal de los limfocitos B que producen anticuerpos contra el antígeno. Como hemos visto un antígeno puede presentar diferentes epítopes, y cada uno de ellos ser reconocido por un clon de linfocitos B que producirá moléculas Ig con una secuencia característica. Por ello en el suero de un animal inmunizado se acumulan un número elevado de diferentes moléculas de Ig , específicas en mayor o menor medida de nuestro antígeno. Se trata de un suero producido por la acción de síntesis de numerosos clones de linfocitos B y por ello se ha denominado policlonal.

Los anticuerpos monoclonales se producen 'in vitro', y son la consecuencia de la actividad de síntesis de un único clon celular de linfocitos B que se ha aislado y se mantiene en cultivo en el laboratorio. El proceso de obtención de un anticuerpo monoclonal es complejo (puedes encontrar un buen protocolo en "Production of Monoclonal Antibodies" de G.K. Lewis) y se basa en la inmunización de un ratón Balbc. Se disgrega el bazo del ratón inmunizado, donde se acumulan los linfocitos B que tienen una escasa viabilidad en cultivo, y se fusionan con células de mieloma deficientes en enzimas implicados en la síntesis 'de novo' del DNA como la timidina kinasa (TK) o la hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT). Los productos de la fusión celular (hibridomas) son cultivados en medio HAT (de hipoxantina, aminopterina y timidina) donde las células mielómicas son eliminadas. Tan sólo las células producto de la fusión entre un linfocito y una célula de mieloma son capaces de crecer en medio HAT. Las células híbridas obtenidas tras el proceso de fusión son heterocariontes y contienen un número elevado de cromosomas (72 del mieloma y 40 del linfocito B) que en las sucesivas divisiones se irán perdiendo hasta oscilar entre los 70 y los 80 cromosomas. Como consecuencia de dicho proceso algunas células pierden la capacidad de secreción de anticuerpos o bien funciones básicas para la viabilidad celular. Por ello tan pronto como se identifica como positivo un pocillo se somete a un proceso de clonación para evitar el crecimiento de células no productoras que al ser metabólicamente más eficientes acabarían por dominar el cultivo.

Anicuerpos recombinantes
En la actualidad existe la tecnología necesaria para la producción de anticuerpos en ausencia de inmunización del animal. Es la denominada tecnología de los anticuerpos recombinantes. Los recientes avances en la tecnología génica han facilitado en gran medida la manipulación genética, producción, identificación y conjugación de fragmentos de anticuerpos recombinantes, obteniéndose nuevos anticuerpos multivalentes y multiespecíficos.

Estrategias para la obtención de moléculas con especificidad de reconocimiento. Son muy interesantes los protocolos seguidos por Ward (1989) y por Huse (1989). Como diferencias significativas entre ambos cabe destacar el material de partida (DNA total en el primero y mRNA en el segundo), el tipo de secuencias amplificadas (cadenas Hv o cadenas Hv y Lv respectivamente), la recombinación aleatoria de estas últimas que se realiza en elsegundo protocolo y finalmente la obtención de moléculas con una o dos regiones de reconocimiento específico respectivamente.
Estas tecnologías han permitido desarrollar estrategias de 'screening' de anticuerpos monoclonales fuera del cuerpo humano. Para ello es necesario disponer, en primer lugar de enormes librerias de genes de anticuerpos, usualmente mediante amplificación PCR de cDNA de linfocitos, o, alternativamente, mediante síntesis 'in vitro' de genes usando cebadores randomizados ("randomized wobble"). El método de 'screening' de estas librerias debe tener una eficiencia comparable a la del sistema inmune, lo que se puede conseguir exponiendo en la superficie de microorganismos los anticuerpos producidos. Ejemplos de los microorganismos empleados son los fagos filamentosos como M13 o bacterias. Esta presentación en superficie permite establecer un enlace físico entre la función de unión al antígeno y el gen del anticuerpo, de forma que la afinidad al antígeno permite aislar el microorganismo portador del gen del anticuerpo de interés entre millones de otros. Una vez aislado el clon específico se amplifica para la producción del anticuerpo de interés por ej. en E.coli. Las proteínas de fusión producidas reciben el nombre de fragmentos Fv.